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よくある質問(FAQ)

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(1)ご依頼方法について

▼Q、NGS解析の流れは？
A. 見積依頼→見積書送付→ウェブ注文→サンプル送付→受注→解析→出荷、の流れになります。
お客様には原則として、見積のご依頼・ウェブからのご注文・サンプルのご送付をお願いすることになります。
▼Q、見積の依頼方法は？
A. メールにてご希望の解析内容をお伝えいただくか、ログインサイト※の「お見積り依頼」をご利用ください。
メールでご連絡の際は、ご希望の解析内容、解析サンプル数、サンプルの送付形態（生サンプル/抽出済みDNA/調製済みライブラリなど）をメールにてご連絡ください。お見積りするにあたり、弊社よりメールにて追加情報お尋ねさせていただくことがございます。
▼Q、注文方法は？
A. ログインサイト※より必要事項をご入力後、解析サンプルを弊社宛てにご送付ください。
入力には「NM20XX…」から始まる見積番号が必要になります。見積一覧より該当の見積番号の「注文する」ボタンを選択いただきますとサンプル情報入力画面に遷移します。お見積書に「〇〇アンプリコン解析」の表記がある場合はパッケージ選択項目で「アンプリコン解析」を、それ以外の場合は「カスタム（パッケージ外）」をご選択ください。ご登録情報と拝受したサンプルの照合をもって受注となります。特殊なご依頼や、選択項目がご不明な場合は、メールでもご注文いただけます。
▼Q、注文書の発行は必要か？
A. NGSサービスのご注文にあたり、注文書をご発行いただく必要はございません。
お客様の事務手続き上、発注書や請書がご必要であれば対応させていただきます。恐れ入りますが、書類の雛型はお客様にてご用意いただければ幸いです。

(2)納期について

▼Q、納品までどのくらい？
A. 解析サンプルが弊社に到着してから20営業日以内※の出荷が目安となります。
DNA/RNA抽出などのオプションをご利用の場合や、多検体をご依頼いただく場合は、追加でお日にちをいただきます。なお、繁忙期（12月～3月)につきましては、納期を延長させいただく場合がございます。解析完了次第の出荷となりますが、ご希望の納期がある場合は予めお申し付けください。
※：アンプリコン解析をご依頼でライブラリミックスをお送りいただく場合は、15営業日以内となります。

(3)弊社でのサンプル調製について

▼Q、アンプリコン解析のPCRに使用している試薬は？
A. TaKaRa社のExTaq HSを使用しております。
なお、MiFishによるメタバーコーディング解析につきましては、環境DNA学会が推奨するRoche社のKAPA HiFi HotStart ReadyMixを使用しております。
▼Q、PCR産物やライブラリの精製に使用している試薬は？
Cytiva社のSera-Mag Select磁性ビーズを使用しております。
なお、KAPA HyperPrep Kitsなどを利用して調製する場合は、キット付属の磁性ビーズを使用しております。
▼Q、DNA抽出に使用しているキットは？
A. ファスマックのGenCheck DNA Extraction Kit [Type S/F]を使用しております。
製品特長や使用方法につきましては、下記リンク※をご参考いただければ幸いです。
▼Q、RNA抽出に使用しているキットは？
A. QIAGEＮ社のRNeasy Kitを使用しております。
なお、追加料金を頂戴することで、他のキットを利用して抽出することも可能です。可否や料金につきましてはメールにてご相談ください。
▼Q、ゲノムショットガンライブラリの調製に使用している試薬は？
A. Roche社のKAPA HyperPrep Kitsを使用しております。
DNAのせん断処理は原則として超音波破砕装置を利用しておりますが、DNA濃度が薄い場合や、ショットガンメタゲノム解析の場合には酵素によるせん断を採用しております。
▼Q、RNA-seq用ライブラリの調製に使用している試薬は？
A. Roche社のKAPA RNA HyperPrep Kitsを使用しております。
また、mRNAセレクションが必要な場合はThermo Fisher Scientific社のDynabeads Oligo(dT) 25を使用いたします。また、追加料金をいただくことでプローブハイブリダイゼーションによるrRNA depletionを承ることも可能です。
▼Q、ライブラリ調製の際のPCR条件は？（アンプリコン解析）
A. 弊社ホームページで公開している調製方法※をご確認ください。
なお、DNAの量や品質、プライマーの増幅効率に応じてPCRサイクル数などの条件を調整させていただきます。最終的な実験条件は出荷時の解析報告書に記載しております。また、見積ご依頼時にPCR条件をご指定いただくことも可能ですので、お気軽にお申し付けください。
▼Q、ライブラリミックスまで自分で調製する場合、プライマーは提供されるのか？
A. 1st PCR用プライマーは1セットまで、2nd PCR用プライマーはサンプル数分を無償で提供しております。
アンプリコンライブラリの調製方法につきましては、下記リンクをご参考いただければ幸いです。

(4)サンプルの送付方法・受け入れ条件について

▼Q、サンプルの送付先の住所等は？
A. 下記住所へ冷凍便・平日必着・着払いにてお送りください。
〒243-0021 神奈川県厚木市岡田3088　ケーオービルA棟4階
株式会社ファスマック バイオ研究支援事業部 NGSグループ 宛
Tel : 046-281-9909
▼Q、ライブラリミックスの受け入れ条件は？（アンプリコン解析）
A. 10 ng/µL以上・20 µL以上のライブラリミックスをご郵送ください。
▼Q、DNAの受け入れ条件は？（アンプリコン解析）
A. 5 ng/μL ・20 μL以上のDNA溶液をご郵送ください。
▼Q、DNAの受け入れ条件は？（ショットガンメタゲノム解析）
A. 10 ng/μL ・50 μL以上のDNA溶液をご郵送ください。
▼Q、RNAの受け入れ条件は？（RNA-seq解析）
A. 50 ng/μL以上・20 μL以上のRNA溶液をご郵送ください。
▼Q、RNAサンプルのDNase処理は必要か？
A. 必ずDNase処理、及び処理後の精製をお願します。
DNA及びDNaseの混入はライブラリ調製不良の原因になりますので、ご注意ください。
▼Q、Rawサンプルの受け入れ条件は？（DNA抽出・RNA抽出）
A. 原則として弊社指定の2 mL抽出用チューブに封入されていることが条件となります。
見積内容をご確認いただき、正式にご注文いただける運びとなりましたら、弊社指定の2 mL抽出用チューブを発送させていただきます。専用チューブに試料を分注していただき、チューブ発送時に同封しておりますご返送用着払い伝票をご利用のうえ、原則※冷凍便でご郵送ください。
※：生菌選択的群集構造解析などを実施する特殊なサンプルは、郵送条件が異なる場合がございますので、郵送前にメールにてお問い合わせください。
▼Q、DNA抽出のための試料はどれくらい送ればよいか？
A. 固形物も液体も200 mgを目安にお送りください。
なお、多数細菌が存在する動物糞便につきましては、50 mg以下の少量でも問題ございません。ご参考までにマウス糞便であれば1粒程度でも十分量（～5 µg）のDNAが抽出可能です。試料の詰めすぎはDNAの回収効率を低下させるだけでなく、状態によっては抽出作業をお断りさせていただくこともございますので、十分ご注意ください。封入時の注意事項につきましては、弊社指定の2.0 mL抽出用チューブの発送時に同封する資料をご参考いただければ幸いです。
▼Q、illuminaライブラリをDNBSEQでラン可能か？
A. 一部可能です。見積依頼時にライブラリ構造やbarcode配列をお送りください。
配列を確認させていただき、ランの可否について回答させていただきます。
▼Q、上記以外のサンプルの受け入れ条件は？
A. サンプルの詳細をご記入の上、メールにてお問い合わせください。
お問合せ先：

(5)プライマーについて

▼Q、1st PCRに使用するプライマーの配列は？（アンプリコン解析：Illumina MiSeq）
A. 弊社で標準的に使用しているプライマーの配列は下記の通りです。
1st PCR_F：5’-[ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT]-[target specific(515F…)]-3’
1st PCR_R：5’-[GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT]-[target specific(806R…)]-3’
・16SV4
515F：5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’
806R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’
Caporaso, J. Gregory, et al. “Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample.” Proceedings of the national academy of sciences 108.supplement_1 (2011): 4516-4522.
・16SV3V4
341F：5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’
805R：5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’
Klindworth, Anna, et al. “Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies.” Nucleic acids research 41.1 (2013): e1-e1.
・ITS
ITS7-F：5’-GTGAATCATCGARTCTTTG-3’
ITS4-R：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’
Ihrmark, Katarina, et al. “New primers to amplify the fungal ITS2 region–evaluation by 454-sequencing of artificial and natural communities.” FEMS microbiology ecology 82.3 (2012): 666-677.
・18SV9
1389F：5’-TTGTACACACCGCCC-3’
1510R：5’-CCTTCYGCAGGTTCACCTAC-3’
Amaral-Zettler, Linda A., et al. “A method for studying protistan diversity using massively parallel sequencing of V9 hypervariable regions of small-subunit ribosomal RNA genes.” PloS one 4.7 (2009): e6372.
・12S (MiFish-U/E-v2)
環境DNA学会推奨のユニバーサルプライマーMiFish-U (硬骨魚類全般)およびMiFish-E-v2 (サメ・エイ類)の混合プライマーです。
MiFish-U-F：5’-NNNNNNGTCGGTAAAACTCGTGCCAGC-3’
MiFish-U-R：5′-NNNNNNCATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG-3’
MiFish-E-F-v2：5’-NNNNNNRGTTGGTAAATCTCGTGCCAGC-3’
MiFish-E-R-v2：5′-NNNNNNGCATAGTGGGGTATCTAATCCTAGTTTG-3’
Minamoto, Miya, et al. “An illustrated manual for environmental DNA research: water sampling guidelines and experimental protocols. ” Environmental DNA 3: 8-13(2021) , https://doi.org/10.1002/edn3.121
▼Q、1st PCRに使用するプライマーを指定することは可能か？（アンプリコン解析：Illumina MiSeq）
A. 可能です。見積依頼時にご希望のプライマー配列をご指定いただければ、
1回のご注文につき、1セットを無償で合成いたします。2セット目からは有償にて合成いたします。
▼Q、2nd PCRに使用するプライマーの配列は？（アンプリコン解析：Illumina MiSeq）
A. 弊社で標準的に使用2ndPCRプライマーの配列は下記の通りです。
2nd PCR_F：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNNNACACTCTTTCCCTACACGACGC-3’
2nd PCR_R：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG-3’
N部分に8塩基のIndex（barcode）が入ります。
▼Q、アダプターライゲーションによるDNAライブラリ調製またはRNAライブラリ調製に使用しているアダプターは？
A. 8 bpのUnique Dual Indexを使用しております。

(6)その他

▼Q、アンプリコン解析によってサンプル中に存在する菌叢の菌種の同定は可能か？
A. 基本的に科～属レベルまで同定可能です。
同定の精度は各種のデータベースへの登録状況に依存します。弊社で採用しているQiime ver.2による解析で使用しているデータベースにつきましては、下記リンク※の ”解析および納品物について” をご参考いただければ幸いです。
▼Q、Qiime ver.1(旧)での解析も実施は可能か？
A. 可能です。特に事前のご希望がない場合はQiime ver.2での解析となります。
Qiime ver.1での解析をご希望の場合は、お見積時にご連絡ください。Qiime ver.1, 2両方の解析をご希望される場合は、解析費用を追加で頂戴させていただきます。
▼Q、シャローショットガンメタゲノム解析によって、菌種の同定は可能か？
A. 基本的に種レベルまで同定可能です。
同定の精度は各種のデータベースへの登録状況に依存します。使用する標準データベースについては、下記リンク※よりご確認ください。より広範なntデータベースに含まれる種についてはメールにてお問い合わせください。
▼Q、遺伝子情報の無い生物種の解析は可能か？
A. de novo RNA-Seq解析にて、網羅的な遺伝子配列取得と発現定量解析が可能です。
▼Q、ChIP-Seqの受け入れは可能か？
A. Immunoprecipitation済みDNAの状態からの受け入れが可能です。
弊社でのクロマチン免疫沈降等は承っておりませんので、ご了承ください。
▼Q、過去にファスマックに依頼した解析について、データ解析のみの依頼は可能か？
A. 可能です。「NJ20XX…」から始まるご注文番号をメールにてご連絡ください。その際、解析内容のご希望についても詳細をお教えください。
▼Q、自身あるいは他社にて出力されたNGSデータの解析を依頼することは可能か？
A. fastqファイルをはじめ、様々なファイル形式に対応しておりますので、お気軽にご相談ください。ご希望の解析内容についての詳細をお伺いさせていただきますので、メールにてお問い合わせください。
▼Q、論文等に使用するための図の作成依頼は可能か？
A. メールにてご相談いただければ可否や料金について回答いたします。
ご希望されている図のイメージの具体的な資料（参考論文など）をご教示いただけますと幸いです。
▼Q、コントロール群と対象群を比較する場合のN数は？
A. 原則としてN＝3以上での比較を推奨しております。
一方、個人差が大きいサンプル（ヒト糞便など）を解析対象とする場合は、N＝10以上を推奨します。なお、RNA-seq解析では1群1サンプルでの発現比較解析も可能ではございますが、統計的な処理ができず、p-valueなどは出力できない点、ご了承ください。
▼Q、実験計画の支援は可能か？
A. メールにてご相談いただければ対応いたします。
その際、研究概要や調査したい事項をご記載ください。ご希望・ご状況に応じてウェブ面談を設けさせていただくことも可能です。
お問い合わせ先
〒243-0021 神奈川県厚木市岡田3088 ケーオービルA棟4階
TEL:046-281-9909 FAX:046-281-9931

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