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GenomeCraft 使用例
● In vitro digestion assay
Cas9蛋白質とsｇRNA又はcrRNA+tracrRNA、基質DNA断片を混合し、
DNA切断実験を行った。37℃にて1時間インキュベート後、
アガロースゲル電気泳動を行った。
● In vivo Genome Editing
Cas9蛋白質とsgRNA又はcrRNA+tracrRNAを混合し、メダカ胚にインジェクションした。
4日胚まで発生させた各個体のゲノムDNAからターゲット領域をPCR増幅してheteroduplex mobility assaysにて変異の検出を行った。
下図の各レーンごとに1個体分の結果を示している。
sgRNA、crRNA+tracrRNA共に変異の存在を示す複数のバンドが観察され、高効率な変異導入ツールであることが確認された。
[データ提供] 京都大学農学研究科 応用生物科学専攻 海洋生物機能学分野 木下政人様
※sgRNA は木下ラボで合成したもの、crRNAとtracrRNA はファスマック提供品を使用。
● ダブルノックアウト(ゼブラフィッシュ)
Cas9蛋白質と2つの遺伝子(spns2：心臓形成に関与、tyr：色素形成に関与)に対するsgRNA又はGENOME CRAFT Type CT(crRNA+tracrRNA)を混合し、ゼブラフィッシュ胚(1-2細胞期)にインジェクションして、発生の様子を観察した。
受精1日後(上段)にGFPで染色された心臓の形成異常(白矢印)が、2日後(下段)には目の色素形成異常(黒矢印)が観察された。これらはそれぞれspns2欠損、tyr欠損の表現型と同一である。
またシークエンス解析により各遺伝子への変異導入が確認された。
[データ提供] 山梨大学大学院 総合研究部 発生生物学教室 川原敦雄 様＊下記文献より改変Kotani H, Taimatsu K et al. “Efficient Multiple Genome Modifications Induced by the crRNAs, tracrRNA and Cas9 Protein Complex in Zebrafish.” PLoS ONE 10(5): e0128319.
● 遺伝子ノックイン(マウス)
Cas9蛋白質とActb遺伝子対するsgRNA又はGENOME CRAFT Type CT(crRNA+tracrRNA) 、
ターゲティングドナーベクターを混合し、マウス受精卵に注入してノックインマウス
(約2.5kbの遺伝子カセット導入)の作成を試みた。注入された受精卵から生まれた
仔マウスに対して、 PCRでWTアリル、ノックイン(KI)アリルの有無調べた。
sgRNAを用いた場合には仔マウス13匹中にKIマウスは得られなかったが
crRNA+tracrRNAを用いた場合では11匹中にKIマウス5匹(*)を得ることができ、
ゲノムの意図した場所へ、正確で高率に遺伝子挿入できることが確認された。
[データ提供] 東京医科歯科大学 難治疾患研究所 分子神経科学分野 相田知海 様, 田中光一 様＊下記文献より改変Aida, Tomomi et al. “Cloning-Free CRISPR/Cas System Facilitates Functional Cassette Knock-in in Mice.” Genome Biology 16.1 (2015): 87.