次世代シーケンス解析(MiSeq)　アンプリコン解析のサンプル調製について

各ステップの詳しい情報

テンプレートDNAについて

経験上1～5 ng程度のDNA量を推奨しております。

また、DNA抽出については市販のDNA抽出キットをご利用していただければ問題ございません。

参考として弊社の取り扱う製品をご案内させていただきます。

土壌・糞便用DNA抽出キット GenCheck® DNA Extraction Kit [TypeS/F]

PCRの条件について

16SrRNAのアンプリコン解析ではバクテリアの16SrRNAをターゲットとしているので、

1st PCRのサイクル数を上げすぎると非特異的な増幅（ネガティブコントロールでも増幅してしまう）

が起こってしまう可能性がございます。 弊社では以下の条件でPCRを行なっております。

1st PCR

PCR酵素：ExTaq HS (TaKaRa)

※弊社ではPCR酵素にExTaq HS (TaKaRa)を使用しておりますが、お客様が普段ご利用されている

PCR酵素のご利用で問題ございません。

反応条件：[94℃-2 min]×1→[94℃-30 sec,50℃-30 sec,72℃-30 sec]×20→[72℃-5 min]×1→[4℃-∞]

↓

ビーズ精製

↓

2nd PCR (tailed PCR)

PCR酵素：ExTaq HS (TaKaRa)

反応条件：[94℃-2 min]×1→[94℃-30 sec,60℃-30 sec,72℃-30 sec]×8→[72℃-5 min]×1→[4℃-∞]

※1stPCR後に精製したサンプルの1/10程度を2ndPCRのテンプレートに使用

↓

ビーズ精製

PCR産物の精製について

上記でご説明しているとおり、2ndPCRに用いるプライマーはMiSeqでの解析（SBS法）に必要な配列

を含んでおります。MiSeqでの解析時に2ndPCRに用いるプライマーが含まれていると、

2ndPCR用プライマーが優先的に解析されてしまい、データの取得が困難となってしまう可能性がございます。

PCR産物精製で最も重要なのはプライマーの除去です。

弊社ではビーズ精製を行っています（cytiva Sera-Mag™ Select等を使用）。

カラム精製でも問題ないと判断しておりますが、経験上ビーズ精製を推奨しております。

各PCR産物の等量混合について

精製後、各サンプルを光度計等を用いて濃度測定します。

※2本鎖のみを定量できるQubitを利用した方がより正確性は向上します。

測定の結果一番濃度が薄いサンプルの濃度に他のサンプルの濃度を合わせて等量混合します。

最終的に10-20 ng/μlの濃度で数十μl程度あれば問題ございません。

これ以下の場合であっても送付いただいて問題ございません。

※一番濃度が薄いサンプルの濃度が上記（10-20 ng/μl）をかなり下回る場合はご連絡願います。