DNAシーケンス解析 よくある質問(FAQ)

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(1)サンプル送付・ご依頼方法について

▼Q、プレートで輸送途中の漏れを防止するためには?
A. プレートシールの貼りがあまいと、配送途中に漏れてしまい、コンタミの原因となる恐れがございます。
シールを強く貼り、クッション材などでサンプルを固定し、冷凍便ならびに天地無用とご指定頂ければ、漏れる可能性が少なくなります。
またプレートシールにつきましては、普段お使いの粘着性シールをお使いいただいて構いませんが、お持ちで無い場合は下記のアルミシールをお勧めしております。
676090 aluseal 100枚入り 定価¥15,000 (アルミタイプ)
貼りやすくもれにくいタイプです。PCRには使用できませんのでご注意ください。
(ご希望の場合には、グライナー・ジャパンまでご連絡ください。)
▼Q、サンプル発送器材の指定は?
A. サンプル発送器材については特に指定はございません。
破損しにくい丈夫なものでお送りいただければと存じます。
※プレートにつきましては、作業の都合上、平底以外のプレートを推奨しております。
Premixプレート解析をご利用予定で、平底以外のプレートをお持ちでない場合には、弊社から無償にて提供いたしておりますので、是非お申し付けください。
▼Q、サンプル送料について
A.(Premix2解析・レンタル解析) → 着払いでお送りいただけます。
※Premix2シングルLite解析 3サンプル以下、レンタル解析 7サンプル以下でのご依頼分の送付は ¥1,000 送料申し受けます。
その他の解析につきましては、直接お問い合わせください。
▼Q、配送業者の指定は?
A. 配送業者の指定は特にございませんが、弊社ではヤマト運輸および日通航空のご利用をお勧めしております。
ご希望の場合には、専用の配送伝票を送付させていただきます。
※遠隔地(北海道、北東北、中四国、九州・沖縄)のお客様につきましては、翌営業日の午前着が可能な日通航空のご利用をお勧めしております。
▼Q、初めて依頼をするのですが?
A .弊社シーケンスサービスをご利用いただくにあたり、ご登録が必要となります。
ご登録ならびにご依頼の際には、弊社Webサイトをご利用いただきますようお願いいたします。
上記URLより、「新規ユーザー登録」をクリックしてユーザー登録を行ってください。
※お客様にてご登録後すぐにご注文が可能となります。
また、ご注文後には、別途シーケンス解析につきましてご案内のメールをお送りさせていただきます。
ご注文につきましては、下記2種類の方法にてご依頼いただけます。
1. 直接入力
解析種別を選択していただき、解析名などを直接入力頂き、ご注文が可能でございます。
2. 専用のオーダーシートによる取り込み
専用のオーダーシートを取り込むことにより、ご注文が可能でございます。
弊社Webサイトに各種オーダーシートをご用意いたしておりますので、ダウンロードいただき、ご利用ください。
ご注文完了後、バーコード付きのオーダーシートが発行されますので、印刷しサンプルへの同封を お願いいたします。
なお、Webサイトへログインする際、ご登録メールアドレスならびにパスワードが必要となります。

(2)解析について

▼Q、解析に使用しているシーケンサーおよび試薬を教えてください。
A. 弊社では解析に以下のものを使用しております。
[シーケンサー]
  • Applied Biosystems 3130xl Genetic Analyzer
  • Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer
[反応試薬]
  • Applied Biosystems Big Dye Terminator V3.1
▼Q、シーケンス反応の条件を教えてください。
A. 誠に申し訳ございませんが、弊社の技術情報としてシーケンス反応の条件を開示することができません。
しかしながら、ライフテクノロジーズ社の推奨するプロトコールに基づき、反応を行っておりますので、是非ご参照ください。
▼Q、波形データが開けなかったのですが
A. お送りする波形データはab1ファイル形式のものとなっております。
解析ソフトをお持ちでない場合にはフリーの解析ソフトを個別にご案内しておりますので、ご相談ください。
ただ解析ソフトによっては波形の得られていないデータについて、ab1ファイルが開けない場合もあるようです。その場合には一緒にお送りする配列データ(TXTファイル形式)が「NNNNN」となっているかと存じます。
▼Q、納品された配列データは何baseまで信頼性があるのでしょうか?
A. 信頼性の高いデータ長(解読base数)はご依頼いただく解析種別、つまり泳動時間によって異なります。
2hr (ワンパス、Premix1)の場合、解読base数は700-800base、 1hr (Premix2解析、レンタル解析)の場合、解読base数は600-700baseとさせていただいております。
配列データと波形データを併せてご確認いただくことをお勧めいたしております。
▼Q、再解析について
A. 初回の解析で良好な結果が得られず、改善の見込みがあると思われた場合、反応試薬または反応条件を変更して再解析を行います。
GT richやG richが疑われる場合にdGTPkitを使用するなど。
ただし、Premix2解析、レンタル解析、セミレンタル解析は、再解析ならびに反応条件変更のサポートは行っておりませんのであらかじめご了承ください。
※Premixプレート解析につきましては、温度条件の変更を承っております。Bisulfite処理済サンプルは専用のプロトコールをご用意しておりますので、ご依頼時にご相談いただければ幸いです。
▼Q、プライマー直近の配列が読めないのですが
A. シーケンサーはキャピラリー電気泳動に基づいております。
プライマー3’末端から数十baseは分画範囲外となるため、解読が困難となります。プライマーの設計位置等を再検討いただければ幸いでございます。
▼Q、配列の信頼性は?
A. 波形の上に塩基がコールされていると思いますが、その上に正確性を現す値(Quality Value)が記載されております。
カーソルを当てていただきますと、QV値が表示され、その塩基のエラー率がどのくらいであるかを見ていただくことが出来ます。
ライフテクノロジーズ社の推奨する「正確である」という最下限がQV=20という値になります。これは、エラー率1%という値で、「この塩基を100回シーケンスで読んだ場合、1回位の割合で違う塩基であるとコールされる可能性がある」という値になります。
※弊社よりお送りするシーケンス解析結果は、あくまでもシーケンサーにより出力されたデータであり、実際の配列を完全保証するものではございません。予めご理解の程、宜しくお願い申し上げます。
▼Q、(100base以下のPCR産物について)良好な結果が得られなかったのですが
A. シーケンス解析の特性上、プライマー3’末端から数十baseは解読が難しくなります。
サンプルの長さが短い場合、ほとんど波形を得ることができません。短いPCR産物の全長を解析する場合、プラスミドベクターにクローニングしていただくことが確実でございます。お手数おかけいたしますが、ご検討くださいますようお願いいたします。

(3)サンプル調製について

▼Q、調製に使用するバッファーは?
A. TEや滅菌水をご利用ください。 ただし、TE中のEDTAの量が過剰にございますと、シーケンス反応に影響を及ぼす可能性があるため、弊社では滅菌水による調製をお勧めしております。
▼Q、テンプレートDNAの精製方法は?
A. テンプレートDNA の品質が低い場合、解析結果に影響を及ぼすことがあります。
(バックグラウンドが高い、ピークが重なる、シグナルが弱いなど)
テンプレートDNA は市販の精製キットによる抽出・精製を行ってください。
PCR 産物は、PCR 反応後、電気泳動によりシングルバンドであることをご確認いただき、精製キットにより、未反応のプライマーやdNTP 等を除去してください。
▼Q、Exo-Star、Exo-SAP-ITのような簡易精製でも大丈夫ですか?
A. 簡易精製を行なったサンプルの解析についても承った実績はあり、概ね良好な解析結果が得られているかと存じます。
しかしながら、解析結果としては「波形に少々バックグラウンドが出る」、「波形後半の分解能がやや悪い」といった波形の乱れが生じる場合もございますので、予めご了承ください。

(4)納期について

▼Q、納期の換算方法は?
A. 納期はお送りいただいたサンプルの到着日を0営業日として換算しております。
土日・祝日は営業日に含まれませんのであらかじめご了承ください。
また下記解析サービスにつきましては午後にサンプルが到着した場合、納期が+1営業日となります。
【Premix2解析プレート(ゆとり)プラン、ワンパス解析、ノーマル解析】
▼Q、Premixプレート解析の納期について
A. Premixプレートにつきましては、以下の2種類のプランをご用意しており、それぞれ納期が異なります。
「超特急」プラン→納期:サンプル到着翌営業日(¥38,400/プレート)
「ゆとり」プラン→納期:3営業日(¥33,600/プレート)
ご希望の納期および価格に応じてお使い分けいただければと存じます。
上記納期の適用は、3プレートまでとさせていただいております。
※土日・祝日は営業日に含まれませんのであらかじめご了承ください。
4プレート以上でご依頼いただいた場合、納期につきましては枚数に応じて加算させていただきます。
「超特急」プラン:3プレートごとに納期を+2営業日、「ゆとり」プラン:3プレートごとに納期を+3営業日
(例) 以下、到着日を0営業日として納期換算
「超特急」プラン6プレートのご依頼 →1~3プレートは翌営業日、4~6プレートは3営業日。
「超特急」プラン3プレート、「ゆとり」プラン3プレートのご依頼 →「超特急」プランは翌営業日、 「ゆとり」プランは3営業日
また、別日にご依頼いただいた場合で、さらに前回ご依頼いただいた分の出荷が済んでいない場合には、前回ご依頼いただいた分の最終出荷日を到着日として換算させていただきますので、予めご了承ください。
(例) Premixプレート「超特急」プランで月曜日に6プレート、火曜日に3プレートご依頼いただいた場合
月曜日 ご依頼 (6プレート)
火曜日 3プレート ご報告 ご依頼 (3プレート)
水曜日 ↓ ↓
木曜日 3プレート ご報告
金曜日
土曜日
日曜日
月曜日 3プレート ご報告
▼Q、オプション追加と納期について
A. オプションによっては、納期を1営業日加算させていただくことがございます(PCR産物精製、データアセンブルなど)。
あらかじめご了承ください。
▼Q、再泳動・再解析が必要になった場合
A. 弊社ではお客様により高品質なデータをお届けするために、必要に応じて再泳動もしくは再解析を行うため、ご連絡した納期に解析データをお届けできない場合がございます。
▼Q、サンプル数が大量の場合
A. サンプル数によっては通常納期に日数を加算させていただき、延長することがございます。
その場合には、解析受注のご報告時に加算した納期をご連絡させていただきます。

(5)プライマーについて

▼Q、シーケンスプライマーを設計する上で最適な条件を教えてください。
A. 弊社ではシーケンスプライマーを別途ご用意することをお勧めしております。
設計の際には、下記をご参考いただければ幸いです。
  • base数:18base以上20base前後で設計。
  • Tm値:55-60℃
  • GC含量:50-55%
その他、ヘアピンなどの2次構造の形成、プライマーダイマーの形成、非特異的アニーリングが起こらないように設計してください。また、弊社ではアニーリング温度を通常50℃に設定しております。
▼Q、PCRに使用したものをシーケンスに利用できますか?
A. 弊社では上記の通り、シーケンス用に特化した条件でプライマーを設計することをお勧めしておりますが、利用することは可能です。
ただし、シーケンス結果に影響を及ぼすことがございます(バックグラウンドが生じるなど)。
▼Q、(Premix解析ご利用のお客様で)ユニバーサルプライマーを利用したいのですが?
A. 大変申し訳ございませんが、Premix解析におきまして、弊社ではテンプレートDNAとプライマーの混合を行っておらず、お客様自身で混合いただくサービスとなります。
ただしご希望いただければ、弊社で使用しておりますユニバーサルプライマーの配列をお知らせいたします。

(6)トラブルシューティングガイド

ここでは、解析データの現象に応じて、考えられる主な要因を例として挙げております。
※ただし、以下に挙げる要因は必ずしも結果に対する原因として保証するものではございません。予めご了承ください。
▼Q、1.シグナルが得られない、シグナルが弱い
  • テンプレートDNA、プライマーの純度が適当でない(過剰な塩が存在するなど)。
  • テンプレートDNA、プライマーの濃度が適当でない(低い)。
  • プライマーのアニーリングサイトが存在しない。
  • プライマーのアニーリング温度が適当でない。
▼Q、2.Top Heavy data
  • テンプレートDNAが過剰に存在している。
  • プライマーダイマーの形成。
▼Q、3.シグナル低下/反応停止
  • テンプレートDNAが2次構造を形成している。
  • G-C rich領域、A-T rich領域の存在。
  • プライマーダイマーの形成。
  • 過剰な塩、EDTAの存在。エタノールの残存。
▼Q、4.バックグラウンド/波形の重なりが生じる
  • テンプレートDNA、プライマーが複数存在する。
  • プライマーのアニーリングサイトが複数存在する。
▼Q、5.特定箇所からバックグラウンド、波形の重なりが生じる
  • プラスミドの場合、複数コロニーが混在した恐れがある。
  • PCRの場合、精製時に混在した恐れがある。
  • フレームシフト変異。
  • ホモポリマー領域の存在により、Emzyme slippageを起こしている。
▼Q、6.70-90base付近にノイズが生じている(Dye Blobs)
  • 反応が良好に進行せず、利用されなかった標識dyeが過剰に残ったため、 精製により除去できず残存した時に見られる現象。主な原因は1と同じ。